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            冰凍切片
             




            實驗方法原理:冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接用切片機切片。它實際上是以水為包埋劑,將組織進行冰凍至堅硬后切片的。在冰凍切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程,大大縮短了制片時間。同時,由于此法不需要經過脫水、透明和浸蠟等步驟,因而較適合于脂肪、神經組織和一些組織化學的制片,并作為快速切片的方法應用在臨床診斷。

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            冰凍切片機

            實驗材料新鮮組織

            試劑、試劑盒:H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性樹膠

            儀器、耗材OCT速凍架恒冷箱切片機烘箱熒光顯微鏡


            冰凍切片可用于免疫熒光

            實驗步驟

            一取材

            應盡可能快地采取新鮮的材料,防止組織發生死后變化。

            二速凍

            1、將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(直徑約2cm)。

            2、如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內。

            3、當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰,此時小盒保持原位切勿浸入液氮中,大約10-20s組織即迅速冰結成塊。

            4、在制成凍塊后,即可置入恒冷箱切片機冰凍切片。

            5、若需要保存,應快速以鋁箔或塑料薄膜封包,立即置入-80℃冰箱貯存備用。

            三固定

            1、樣品托上涂一層OCT包埋膠,將速凍組織置于其上,4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。

            2、取下組織置于錫箔或者玻片上,樣品托速凍。

            3、組織置于樣品托上,其上再添一層OCT膠,以完全覆蓋為宜,速凍架(PE)上30min。

            四切片

            1、恒溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機,其基本結構是將切片機置于低溫密閉室內,故切片時不受外界溫度和環境影響,可連續切薄片至5-10&mu;m。

            2、切片時,低溫室內溫度以-15℃ ~ -20℃為宜,溫度過低組織易破碎,抗卷板的位置及角度要適當,載玻片附貼組織切片,切勿上下移動。

            3、切好室溫放置30min后,入4℃丙酮固定5-10min,烘箱干燥20min。PBS洗5min&times;3。

            4、進行抗原熱修復,微波熱修復也可,室溫自然冷卻??捎?%H2O2孵育5-10min,消除內源性過氧化物酶的活性。

            五免疫熒光染色

            1、冰凍切片室溫晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時(此步可不洗)。

            2、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液(抗體的量視組織大小而定,原則是可以均勻覆蓋組織面,且保證整個過程中不會使組織干涸)。

            3、將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒,室溫孵育2小時或4℃過夜。

            4、第二天先將濕盒放到37℃回溫1h,然后吸取片上的一抗進行回收,將切片插入到小染缸PBS沖洗。

            5、滴加用PBS稀釋好的二抗(避光)置于分子雜交箱中37℃孵育1小時?;厥斩?,切片置于染缸內,PBS洗5min&times;3次。

            6、滴加DAPI工作液染核,室溫10-20min(工作濃度0.1%染色15min)。

            7、回收DAPI,滴加5-10&mu;l抗熒光衰減封片劑或中性樹膠,用處理干凈的蓋玻片封片,即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

            8、做好的切片放在切片盒內,置于4℃冰箱,可保存一周左右。

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