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            DCFH-DA探針檢測細胞ROS


             

            活性氧檢測試劑盒(Reactive oxygen species assay kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細胞膜,進入細胞內后,可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜,從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。 本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup以便于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物(compound mixture),濃度為50mg/ml。
            一、注意事項
            1、探針裝載后,一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針,否則會導致背景較高。
            2、探針裝載完畢并洗凈殘余探針后,可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描,以確認探針的裝載情況是否良好。
            3、盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間(刺激時間除外),以減少各種可能的誤差。
            4、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
            二、使用說明
            1、裝載探針
            對于刺激時間較短(通常為2小時以內)的細胞,先裝載探針,后用活性氧陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激
            時間較長(通常為6小時以上)的細胞,先用活性氧陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞,后裝載探針。
            原位裝載探針:本方法僅適用于貼壁培養細胞。按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養液,加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜,通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA的體積為1毫升。37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

            通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
            收集細胞后裝載探針:按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10微摩爾/升。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升,37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞,或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通?;钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?0-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
            2.、檢測
            對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。
            對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測,用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

            3、參數設置
            使用488nm激發波長,525nm發射波長,實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似,可以用FITC的參數設置檢測DCF。DCF的激發光譜和發射光譜參考下圖。
            4、其它說明
            陽性對照可以按照1:1000的比例使用。例如裝載好探針的細胞共1毫升,可以加入1微升的陽性對照刺激。通常刺激后20-30分鐘內可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞,活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內觀察不到活性氧的升高,可以適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快,可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。
            另外,對于某些細胞,如果發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強,可以按照1:2000-1:5000稀釋DCFH-DA,使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時間也可以根據情況在15-60分鐘內適當進行調整。

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