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            新冠病毒核酸RT-PCR檢測



             圖片5.png

            新冠病毒

            新型冠狀病毒(嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2,Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2),最初發現于2019年,也可稱為2019新型冠狀病毒。是乙型冠狀病毒中的一個分型,與2003SARS病毒相似。該病毒株以前從未在人體中發現,人感染后會出現呼吸道癥狀、咳嗽、發燒、呼吸困難,部分患者嗅覺味覺消失,嚴重的病例中出現嚴重的呼吸綜合征、肺炎、肺纖維化、腎衰竭,甚至死亡。該病毒主要通過上呼吸道入侵人體,主要感染肺、心臟、腎等多種器官。

            該病毒具有包膜的、不分節段的正鏈單股RNA病毒,顆粒呈圓形或橢圓形,直徑約80120nm。具有包膜的正鏈單鏈RNA病毒,較容易突變,目前多種變種在全球發現。

            目前病毒檢測主要是核酸檢測和抗原檢測。核酸檢測在病毒感染后就可以檢測出,是檢測病毒感染與否的直接證據,抗原抗體檢測是患者感染3d后出現抗體,是檢測病毒感染的間接證據。

            核酸檢測主要是通過實時熒光定量PCR檢測新冠病毒保守的片段區域的序列,以確定體內是否含有該病毒。當定量PCR檢測出有該序列,說明有可能感染了病毒,會通過多次PCR進行檢測并結合臨床檢測指標進行確診。

            實時熒光定量PCR使用Taqman法進行檢測,使用針對病毒2個或更多的保守區域特異性引物和探針(不同國家或地區檢測的區域不一致,我國主要是檢測ORF1abN區域這2個保守區域)

             1640941919719937.png

            圖片9.png

            1 新冠病毒基因組圖及PCR靶基因檢測區域

             

             1640942005589582.png

            2 核酸檢測流程(據Enzolifesciences

            咽拭子樣本采集后運送至實驗室生物安全柜中直接進行下列處理,樣本也可以在4℃冰箱中儲存不超過7天。

            1)預處理:樣本中加入Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)對粘性樣本進行預處理。

            2)病毒滅活:將50μl樣本在99℃加熱5min,將病毒滅活。將樣本轉移至離心機中4000rpm離心5min。(有的試劑盒需要提取核酸)

            3)逆轉錄+PCR檢測:取5μl樣本加入逆轉錄和PCR反應體系中。

            反應體系包含:逆轉錄酶、DNA聚合酶、特異性引物、特異性probe,并使用乙肝病毒HBVS抗原序列作為內控。


            PCR mix體系

            成分

            體積(μl

            RT-PCR mix

            12.5

            forward primer

            400nM

            reverse primer

            400nM

            PCR probe

            200nM

            sample

            5

            Rnase free H2O

            up to 25

            total

            25

             

            PCR反應程序

            程序

            溫度

            時間


            循環數

            逆轉錄

            99

            30s

            變性

            1cycle

            60

            5min

            逆轉錄

            PCR

            90

            5s

            變性

            45cycle

            60

            30s

            退火/延伸

             

            4)結果判讀:

            PCR檢測結束后,定量PCR儀會有每個樣本檢測的Ct值,當檢測樣本兩個檢測位點無Ct值或者>38時,判斷為陰性,當兩個檢測位點Ct<38時,是陽性,當兩個檢測位點Ct值在38左右不一致是,需要再次進行復檢。

            Ct值陽性時,醫生會結合流行病學接觸史和影像學檢查結合進行綜合判斷。

             更多相關文章:PCR檢測報告案例 關于PCR檢測

             


            CHIRP 檢測 沒有了!
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